HCY™ HotStart SYBR Green qPCR Master Mix(2×, No Rox)

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【产品组分】

名称	规格	型号	数量
HCY™ HotStart SYBR Green qPCR Master Mix (2×)	50μl×40T/tube	M00713M01	5管

【保质期】

12个月

【保存条件】

长期存放请置于-20℃避光保存。如需频繁使用，可分装后存放于4℃，避免反复冻融。解冻后应充分混匀，避免产生大量气泡。

【试剂组成】

HCY™ HotStart SYBR Green qPCR Master Mix (2×)含有PCR Buffer、MgCl₂、dNTPs、HS-Taq DNA Polymerase、稳定剂等成分。

【产品简介】

HCY™ HS-Taq DNA Polymerase基于HCY™ Taq DNA聚合酶，经过特殊化学修饰法修饰而成。HCY™ HS-Taq DNA Polymerase具有5’-3’DNA聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，无3’-5’外切酶活性。产物3’端带A碱基，可直接用TA载体克隆。

HCY™ HS-Taq DNA Polymerase活性只有经过98℃ 10分钟预变性后才被激活，可抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。使用本产品进行PCR反应时可以在室温操作，并能有效避免室温操作时由于普通Taq酶或其它耐热DNA聚合酶存在活性而导致的非特异性PCR背景。

HCY™ HotStart SYBR Green qPCR Master Mix (2×)适用于采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR定性、定量反应的检测。

本产品含HCY™ HS-Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I荧光染料等所有的通用组分，只需要加入模板、引物和水即可进行PCR扩增。本产品采用优化配方的qPCR专用Buffer，可以在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，准确进行定量。本产品与多数厂家的荧光定量PCR仪兼容，如Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad和Roche等。

【试剂原理】

本产品利用Taq DNA polymerase进行qPCR 扩增反应，通过扩增产物嵌合SYBR Green I而激发的荧光信号强度进行检测。

1、PCR

PCR法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增大量DNA片段。

2、荧光检出

SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强，最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

 SYBR Green I可以与所有的双链DNA相结合，无需使用探针，即可实现检测，通用性好，且灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。在定量仪器检测过程中，可以通过测量升高温度后荧光的变化，由解链曲线来分析产物的均一性，从而区分产物的融解峰温度而区分特异与非特异的产物。

【PCR反应体系】

1. 融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。HCY™ HotStart SYBR Green qPCR Master Mix (2×)完全融解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。
2. 参考下表在室温或冰浴上设置PCR反应体系：

组分	20ul体系(μl)	50ul体系(μl)	终浓度
HCY™ HotStart SYBR Green qPCR Master Mix (2×)	10	25	1×
模板dna	*	*	*
引物1	0.4-2	1~5	0.2-1.0μM
引物2	0.4-2	1~5	0.2-1.0μM
灭菌水	up to 20 μl	up to 50 μl

注意事项:

• 通常引物终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。
• 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因组DNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不超过PCR反应总体积的10%。
• 用移液器轻轻吹打混匀或轻微震荡混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
• 将配制好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。

【PCR反应条件】

两步法			三步法
热启动	98℃ 10 分钟		热启动	98℃ 10 分钟
变  性	95℃ 10~20 秒	35-45个循环	变  性	95℃ 10~20 秒	35-45个循环
退火/延伸	60℃ 20~60 秒		退  火	56-64℃ 10~30 秒
熔解曲线分析	仪器默认设置		延  伸	72℃ 10~60 秒
			熔解曲线分析	仪器默认设置

注意事项：

1. 聚合酶活性只有经过98℃ 10分钟预变性后才被激活,请勿缩短时间或降低温度。
2. 对于退火温度较低的引物或超过 200bp 长片段扩增建议采用三步法；
3. 扩增前后要使用专用的区域和移液器，戴手套操作并经常更换，PCR反应完成后切勿打开反应管。以最大限度的减少PCR产物对样品的污染。

【质量控制】

1. 功能检测：qPCR的敏感性、特异性、可重复性；
2. 无外源核酸酶活性，无外源内切、外切核酸酶污染；
3. 无表达宿主核酸残留。

注意：本产品仅供科学研究使用，不能用于人、动物的医疗或诊断程序，不能使用本产品作为食品、化妆品或家庭用品等。未经书面许可授权或批准，不得制造、许诺销售、销售或进出口本产品，或者使用产品所有的相关专利及相关商标。