HCY™ HotStart Taqman qPCR Master Mix(2×, With Seperate Rox)

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【产品名称】

HCY™ HotStart Taqman qPCR Master Mix(2×, With Seperate Rox)

【产品货号】

M00712K501

【产品组分】

名称	规格	型号	数量
HCY™ HotStart Taqman qPCR Master Mix (2×)	50μl×40T/tube	M00711M01	5管
ROX reference dye (25 μM)	100 μl/tube	MR006110	2管

【保质期】

12个月

【保存条件】

长期存放请置于-20℃避光保存。如需频繁使用，可分装后存放于4℃，避免反复冻融。解冻后应充分混匀，避免产生大量气泡。

【试剂组成】

HCY™ HotStart Taqman qPCR Master Mix (2×)含有PCR Buffer、MgCl₂、dNTPs、HS-Taq DNA Polymerase、稳定剂等成分。

【产品简介】

HCY™ HS-Taq DNA Polymerase基于HCY™ Taq DNA聚合酶，经过特殊化学修饰法修饰而成。HCY™ HS-Taq DNA Polymerase具有5’-3’DNA聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，无3’-5’外切酶活性。产物3’端带A碱基，可直接用TA载体克隆。

HCY™ HS-Taq DNA Polymerase活性只有经过98℃ 10分钟预变性后才被激活，可抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。使用本产品进行PCR反应时可以在室温操作，并能有效避免室温操作时由于普通Taq酶或其它耐热DNA聚合酶存在活性而导致的非特异性PCR背景。

HCY™ HotStart Taqman qPCR Master Mix (2×)适用于采用探针法进行Real Time PCR定性、定量反应的检测。

本产品含HCY™ HS-Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg²⁺等所有的通用组分，只需要加入模板、引物、探针和水即可进行PCR扩增。本产品采用优化配方的qPCR专用Buffer，可以在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，准确进行定量。本产品与多数厂家的荧光定量PCR仪兼容，如Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad和Roche等。

本产品含独立包装ROX，适用于需ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器选择添加ROX浓度。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

仪器型号	ROX 用量(50 µl PCR 反应体系)	ROX 终浓度
Applied Biosystems 5700, Applied Biosystems 7000, Applied Biosystems 7300, Applied Biosystems 7700, Applied Biosystems 7900, Applied Biosystems 7900HT, Applied Biosystems 7900 HT Fast, Applied Biosystems StepOne™ and Applied Biosystems StepOnePlus™	1.0 µl(0.6~1.0 µl)	500 nM(300~500 nM)
Applied Biosystems 7500, Applied Biosystems 7500 Fast, Stratagene Mx3000P®, Stratagene Mx3005P™, Stratagene Mx4000™, Applied Biosystems ViiA 7 and Applied Biosystems QuantStudio™ 12K Flex, QuantStudio® 3, QuantStudio® 5	0.1 µl(0.06~0.1 µl)	50 nM(30~50 nM)

【试剂原理】

本产品利用Taq DNA polymerase进行qPCR扩增反应，通过探针和目标基因发生特异性的结合，生成荧光信号进行检测。

1、PCR

PCR 法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增大量 DNA 片段。

2、荧光检出

探针法qPCR不使用荧光染料如SYBR Green等对PCR产物进行荧光染色，而是采用了荧光基团和淬灭基团标记的DNA探针靶向拟通过PCR检测的目标序列。正常情况下，探针上的淬灭基团由于空间上的荧光共振能力转移（FRET）而导致荧光基团淬灭。在PCR反应扩增目标序列时，引物和探针都会退火到目标基因上，随着引物的延伸，Taq酶的5’→3’外切酶活性会导致结合在目标序列上的探针从5’端开始逐渐被降解。探针的荧光基团和淬灭基团被Taq酶切开后，淬灭基团的作用消失，荧光基团就能正常地被激发光所激发而产生荧光。每经过一个PCR循环，就会有更多的荧光基团被释放，荧光强度与新合成的目标片段数量成正比，从而就可以实现定量检测了。探针通常是目标序列特异性的一段线性DNA，5’端标记FAM或HEX等荧光基团，3’端标记BHQ1、TAMRA或MGB等荧光淬灭基团。

本产品的特异性好、灵敏度高。特异性并不仅仅依赖于PCR引物，还依赖于探针的特异性，探针和目标基因发生特异性的结合，才能生成荧光信号，检测灵敏度和特异性通常要显著高于使用SYBR Green等荧光染料的方法。

【PCR反应体系】

1. 融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。HCY™ HotStart Taqman qPCR Master Mix (2×)完全融解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。
2. 参考下表在室温或冰浴上设置PCR反应体系：

组分	20ul体系(μl)	终浓度
HCY™ HotStart Taqman qPCR Master Mix (2×)	10	1×
模板dna	*	1-50ng
引物1	1	0.5μM
引物2	1	0.5μM
探针	0.5	0.25μM
ROX reference dye	根据所用仪器选择添加ROX浓度
灭菌水	up to 20 μl

注意事项:

(1) 通常引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。

• 最佳的探针(probe)浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关。实际使用时请参考仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行探针浓度的调节。通常探针的浓度宜低于引物的浓度，例如引物终浓度为0.3μM ，则推荐的探针终浓度为0.2μM，可在0.1-0.3μM范围内调整探针的终浓度。
•  通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因组DNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不超过PCR反应总体积的10%。  
• 用移液器轻轻吹打混匀或轻微震荡混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
• 将配制好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。

【PCR反应条件】

两步法			三步法
热启动	98℃ 10 分钟		热启动	98℃ 10 分钟
变  性	95℃ 10~20 秒	35-45个循环	变  性	95℃ 10~20 秒	35-45个循环
退火/延伸	60℃ 20~60 秒		退  火	56-64℃ 10~30 秒
			延  伸	72℃ 10~60 秒

注意事项：

1. 聚合酶活性只有经过98℃ 10分钟预变性后才被激活,请勿缩短时间或降低温度。
2. 对于退火温度较低的引物或超过200bp长片段扩增建议采用三步法；
3. 扩增前后要使用专用的区域和移液器，戴手套操作并经常更换，PCR反应完成后切勿打开反应管。以最大限度的减少PCR产物对样品的污染。

【质量控制】

1. 功能检测：qPCR的敏感性、特异性、可重复性；
2. 无外源核酸酶活性，无外源内切、外切核酸酶污染；
3. 无表达宿主核酸残留。

注意：本产品仅供科学研究使用，不能用于人、动物的医疗或诊断程序，不能使用本产品作为食品、化妆品或家庭用品等。未经书面许可授权或批准，不得制造、许诺销售、销售或进出口本产品，或者使用产品所有的相关专利及相关商标。